blisko 30 lat po odkryciu niewielkich, podobnych do beczek struktur zwanych kryptami wciąż nie znamy ich funkcji. Jednak nie przeszkadza to naukowcom w rozpoczęciu wykorzystania tych organelli w biomedycynie.

Autorzy: Eufemia S. Putortì and Massimo P. Crippa

W połowie lat 80′ biochemik Leonard Rome z University of California, Los Angeles, (UCLA) School of Medicine i wypromowana przez niego doktor Nancy Kedersha, opracowywali nowe metody oddzielania pęcherzyków różnej wielkości i naładowanych lizatów, wyekstrahowanych ze szczurzych komórek wątrobowych. W trakcie tych badań natknęli się na coś zupełnie nowego. Wykorzystując elektronowy mikroskop transmisyjny do sprawdzenia, czy pęcherzyki w lizatach rozdzielają się prawidłowo, zaobserwowali 3 ciemne struktury: duży pęcherzyk otoczony białkiem, mały pęcherzyk otoczony białkiem i jeszcze mniejszy i mniej zwarty obiekt. Naukowcy nie mieli pojęcia czym ta najmniejsza struktura jest.

Kedersha znała wiele białek i pęcherzyków związanych z błoną, ale ten był inny i na pewno nie był zanieczyszczeniem. Dodatkowo mikrofotografie częściowo oczyszczonych pęcherzyków potwierdziły występowania podobnych, nieznanych obiektów znajdowanych zawsze w towarzystwie opłaszczonych pęcherzyków. Te jajowate struktury wyróżniał szczególny kształt, który przypominał naukowcom malinę, granat ręczny, czy też beczkę ponadto były mniejsze niż jakakolwiek znana organella. Rome zachęcił swoją współpracownicę do dokładniejszych badań.

krypta

MINITAJEMNICA: Elektronowa mikrofotografia wykonana 30 lat temu przez naukowców przedstawia jeden z pierwszych obrazów struktur znanych jako krypty. NANCY KEDERSHA AND LEONARD ROME

Kadersha, bazując na literaturowej procedurze izolowania opłaszczonych pęcherzyków opracowała metodę wychwycenia tajemniczych organelli. Następnie zrobiła zdjęcia zabarwionych struktur mikroskopem elektronowym. Te małe organelle miały złożony, ale powtarzający się, beczkowaty kształt. Ich rozmiar wahał się między 35 a 65 nanometrów (dużo mniejsze od lizosomów, których średnica zaczyna się od 100 i przekracza 1 000 nanometrów (1 mikrometr)), czy też mitochondriów, których długość mieści się miedzy 0,5 a 10 mikrometrów. Kedersha również poddała materiał działaniu różnych proteaz, jak również enzymów trawiących RNA i DNA, wszystko to pozwoliło zidentyfikować składowe, którymi były 3 białka i RNA. Całkowita masa bliska 13 megadaltonom wskazywała, że jest największą odkrytą eukariotyczną rybonukleoproteioną. Dla porównania, rybosomy mierzące 20-25 nanometrów mają ciężar niewiele przekraczający 3 megadaltony.

Porównanie wielkości lizosomu z innymi strukturami komórki

Porównanie wielkości lizosomu z innymi strukturami komórki

Autor: LadyofHats

Źródło: wikipedia.org

Ten utwór został udostępniony jako własność publiczna przez jego autora, LadyofHats. Dotyczy to całego świata.

Kedersha przezwała te struktury „krypty” ze względu na łukowaty kształt pierwszej zaobserwowanej przez nią i Rome organelli przypominający sklepienie katedry (angielskie słowo „vault” ma różne znaczenia. W Polsce wybrano „krypta”, a nie, zgodne z intencją odkrywców, „sklepienie” przyp. tłum.).1 By sprawdzić występowanie tych nowych nanostruktur u innych gatunków, Kedersha przygotowała przeciwciało przeciwko jednemu z odkrytych białek krypt i wykorzystała je do wyizolowania krypt z różnych gatunków zwierząt: te małe beczułki okazały się powszechne w komórkach królików, myszy, kur, krów, ropuch, jeżowców i kilku liniach ludzkich komórek. Ich liczba wahała się między 10 000 a 100 000 na komórkę. Istotne jest, że wszystkie miały podobny rozmiar, morfologię i kształt. Oczywistym było, że odkryte organelle są ważnymi elementami komórek, które nigdy wcześniej nie zostały opisane w literaturze.

Powszechne występowanie i mała zmienność krypt u gatunków eukariotycznych, sugeruje ważne funkcję w komórce, jednak do dziś nie zostały odkryta. Prawdę mówiąc, trzy dekady od odkrycia, krypty nie są ciekawym materiałem dla większości naukowców. Szczęśliwie kilka grup badawczych stara się wyjaśnić czym krypty są i jaka jest ich funkcja. Pojawiają się przypuszczenia, że odgrywają rolę w transporcie, ruchach komórkowych i odporności na leki.

Rozbijanie krypty

Naukowcy kilkukrotnie próbowali opisać strukturę maleńkich krypt. Zaprzęgli do tego mikroskopię krioelektronową i freeze-etch oraz obrazowanie trójwymiarowe. Dzięki temu odkryto symetryczną, centralną beczkę z łącznikiem w środku i czepkami sterczącymi z górnej i dolnej części (patrz ilustracja). Przekroje ujawniły bardzo cienki płaszcz otaczający duże, puste wnętrze. Takie wnętrze jest wystarczająco obszerne, by pomieścić cząsteczki duże jak podjednostki rybosomu, jednak naukowcom nie udało się potwierdzić przenoszenia ładunków przez krypty.

Zgodnie ze wstępnymi badaniami budowy przeprowadzonymi przez Kedershe krypty składają się z wielu kopi co najmniej 4 różnych składników: trzech białek i cząsteczki RNA. Większe białko krypty (MVP) stanowi 75% masy składowych cząsteczek i występuje w 78 kopiach. W badaniach, ekspresja MVP w liniach owadzich komórek (owady jako takie są jednymi z niewielu organizmów eukariotycznych nie posiadających krypt), prowadzi do spontanicznego kształtowania cząsteczek charakteryzujących się podobną morfologią do endogennych krypt.2 Innym białkiem znajdowanym w kryptach jest jest kryptyczna poli (ADP-ryboza) polimeraza (VPARP). VPARP i MVP mają podobne ścieżki ekspresji a dokładne wewnątrzkomórkowe badania podkreślają silne powiązanie miedzy oboma białkami.

Trzecią proteiną jest TEP1, wcześniej już zidentyfikowana jako związane z telomerazą białko 1, które spaja RNA z telomerazą. Myszy pozbawione TEP1 nie wykazywały zmian funkcjonowania telomerazy, co wskazuje, że nie jest niezbędna jądru komórki, ale wszystkie wyizolowane z tych mysz krypty nie zawierały czwartego składnika: kryptowego RNA (vRNA), czyli małego, nietranslatowanego RNA, znajdowanego na czubkach organelli. Badania nad TEP1 wykazały, że białko jest niezbędne w przyłączaniu i stabilizacji vRNA.

Technika freeze-etch (opiera się na rozbijaniu zamrożonego, biologicznego materiału i późniejszemu badaniu z użyciem elektronowego mikroskopu transmisyjnego) pozwoliła odkryć, że krypty nie są sztywnymi, nieprzepuszczalnymi strukturami, ale wykazującymi dynamikę jednostkami, które mogą się otwierać i zamykać w sposób przypominający rozkwitanie kwiatu.3 Takie „kwiaty” są obserwowane zazwyczaj w parach, co wskazuje, że nienaruszona krypta składa się z dwóch zwiniętych „kwiatów” po osiem prostokątnych „płatków” każdy, które połączone są z centralnym pierścieniem cienkim, krótkim haczykiem (patrz ilustracja).

Zdolność do otwierania i zamykania wskazuje na funkcje transportowe. Do tej pory nie udało się jednoznacznie potwierdzić takiej funkcji. Prócz transportu naukowcy podejrzewają, że krypty mogą pełnić ponad tuzin innych, takich jak odporność na leki, przekazywanie sygnałów, uszkadzanie neuronów, apoptozy i autofagii.

apoptoza

Preparat mysiej wątroby z komórką wchodzącą w apoptozę (wybarwiona na pomarańczowo)

Autor: Laboratory of Experimental Pathology, Division of Intramural Research, NIEHS (NIH)

Źródło: wikipedia.org

Ten plik znajduje się w domenie publicznej Stanów Zjednoczonych ponieważ jest dziełem urzędnika wykonanym w trakcie służbowych obowiązków podlegających Title 17, Chapter 1, Section 105 of the US Code. zobacz Copyright.

W poszukiwaniu funkcji

struktura krypty

STRUKTURA KRYPT: Krypty są pustymi, beczkowatymi strukturami o wymiarach 35×65 nanometrów. Są symetryczne i fałdowane na całej zewnętrznej powierzchni. © LAURIE O’KEEFE

Krypty występują w cytoplazmie i jak dotąd nie są obserwowane w jądrze (poza jeżowcami4). Rozmieszczenie w cytoplazmie nie jest losowe, występują i oddziałują z elementami cytoszkieletu takimi jak miktofilamenty oraz występują w dużej ilość w wysoce mobilnych komórkach, takich jak makrofagi, co pozwala podejrzewać, że krypty wspomagają ruch.

szkielet komórki eukariotycznej

Szkielet komórki eukariotycznej

Autor: brak danych

Źródło: wikipedia.org

Ten plik znajduje się w domenie publicznej Stanów Zjednoczonych ponieważ jest dziełem urzędnika wykonanym w trakcie służbowych obowiązków podlegających Title 17, Chapter 1, Section 105 of the US Code. zobacz Copyright.

Interakcja z cytoszkieletem pozwala przypuszczać, że te organelle transportują ładunki w obrębie cytoplazmy. Według hipotezy krypty otwierają się, zamykają w sobie cząsteczki, transportują je wzdłuż mikrofilamentów i oddają przenoszoną zawartość w docelowym obszarze komórki.

Po poznaniu „kwiatowej” struktury, Rome i jego zespól zaproponowali dwie hipotezy techniki otwierania krypt. Pierwsza mówi o rozdzieleniu w najszerszym miejscu na dwie, niepołączone połówki. Druga sugeruje podnoszenie przeciwległych „płatków” tworząc zawias w połowie (patrz ilustracja)5. Druga hipoteza wyklucza rozerwanie całej organelli, co umożliwiało by powtarzalny transport materiału. Ostatnio naukowcy odkryli, że krypty „oddychają” pobierając i uwalniając białka bez konieczności pełnego otwarcia.

Wygląda na to, że krypty są również związane jądrowymi kompleksami porowymi (NPC) będącymi konglomeratem białek, które obejmują wewnętrzne i zewnętrzne błony otoczki jądrowej. Być może krypty transportują materiał między cytoplazmą i jądrem. Interesującym jest, że część charakterystyki krypt, taka jak ciężar, średnica i kształt są bardzo podobne do NPC. Naukowcom nie udało się jeszcze ustalić, czy krypty rzeczywiście są rodzajem wtyczki pasującym do NPC.

Kolejną, prawdopodobną funkcją krypt występujących w komórkach rakowych jest oporność na leki. W 1993 immunolog i patolog Rik Scheper oraz jego zespół z VU University w Amsterdamie odkrył, że linia komórek niedrobnokomórkowego raka płuc może być selekcjonowana na odporność na doksorubicinę – leku stosowanego w terapii.6 Tak wybrane komórki nadprodukują duże białko początkowo nazwane resistance-related protein (LRP). Dwa lata później badacze odkryli, że LRP jest niczym więcej niż ludzkim MVP;7 wkrótce literatura zapełniła się publikacjami dotyczącymi potencjalnej roli krypt w odporności na leki stosowane w chemioterapii.

Badania prowadzone nad bezpośrednim udziale MVP w takiej odporności rozwiały nadzieje. Wykluczenie MVP nie wpłynęło na przeżywalność komórek, a zwiększona produkcja tego białka nie powodowała wzrostu odporności na antyrakowe leki.8 Mimo, że wiele badań klinicznych wskazuje MVP jako marker kiepskiej prognozy skuteczności chemioterapii, to brakuje dowodów na bezpośrednią rolę krypt w odporności na leki (może są tylko markerem odpornych fenotypów).

Do roboty, krypty!

fotografia krypt

KWITNĄCE KRYPTY: Poprzecznie rozdzielone krypty wydają się przyjmować kwiatowaty kształt (żółte strzałki). Częściowo otwarte krypty (pomarańczowe strzałki) są widoczne w górnej części elektronowej mikrofotografii. JOHN HEUSER

Mimo wielu pytań pozostających bez odpowiedzi,np.: czy krypty służą komórce do transportowania ładunków? Puste wnętrza w wyobraźni naukowców stawały się narzędziem do transportu biomateriałów. Różnorodne sposoby zamykania biomateriałów są już w użyciu, wykorzystuje się do tego wirusy, liposomy, peptydy, hydrożele oraz naturalne i syntetyczne polimery, ale ich zastosowania są ograniczone ładownością, immunogennością, trudnością w sterowaniu oraz brakiem kontroli nad załadunkiem i rozładunkiem. Krypty, natomiast posiadają wszystkie cechy idealnego „dostawczaka”. Te naturalnie występujące komórkowe nanostruktury mają wnętrze wystarczająco duże, by pomieścić setki białek; są podobne, regularne, wysoce stabilne i łatwe do przeprojektowania. Jednak najważniejsze jest, że nie są immunogenne i są całkowicie biokompatybilne.

Pakowanie obcych materiałów do krypt nie jest takie proste. W 2005 roku Rome i jego długoletnia współpracownica z UCLA – Valerie Kickhoefer odkryła szczególny region na C-końcu VPARP, nazwany obszarem interakcji większego białka krypty (mINT), który odpowiada za przyłączanie VPARP do MVP. Naukowcy zakładają, że mINT służy za rodzaj kodu pocztowego naprowadzającego VPARP do wnętrza krypty, co pozwala przypuszczać, że dowolne białko oznaczone sekwencją mINT na C-końcu może być zapakowane do wnętrza tak jak to ma miejsce z VPARP. Naukowcy przyłączając sekwencję do lucyferazy (enzymu, który powoduje świecenie świetlików) i wywołując ekspresję takiego tworu w komórkach owadów, z powodzeniem uzyskali krypty z zaprojektowanym białkiem zapakowanym do wnętrza w kształt dwóch pierścieni, jaki jest zwyczajowo formowany przez VPARP.9

Od 2005 roku Rome wraz z zespołem udowodnił, że ta technika skutecznie pakuje dowolną liczbę protein do tych małych komórkowych organelli, nawet więcej, potrafi zmienić białka krypt, by wybrać sposób pakowania. Dla przykładu, dołączenie dodatkowych aminokwasów na N-końcu MVP tworzy krypty, które upakowują wybrane białko wyłącznie w najszerszym miejscu krypt. Odwrotny zabieg (dodatkowe aminokwasy na C-końcu MVP) daje efekt dwóch kropli gęsto upakowanych białek na obu końcach krypt. Krypty można też przeprojektować do spajania antyciał, czy też pokrycia ligandami komórek rakowych, co pozwala na precyzyjne dostarczanie biomateriałów do docelowej komórki. Naukowcy mają nadzieje, że po wprowadzeniu do organizmu odpowiednio zaprojektowane krypty będą powoli uwalniać dowolne proteiny.

We współpracy z Romem, grupa patolog Kathleen Kelly z UCLA pracuje nad wytworzeniem spreju do nosa opartego o krypty, który działa jak szczepionka przeciw infekcji chlamydią.10 Zespołowi udało się zaprojektować krypty zawierające główne białko zewnętrznej błony (MOMP) chlamydii, które ma silne właściwości immunogenne. Następnie wytworzyli sprej do nosa w celu dostarczenia zaprojektowanych krypt do błony śluzowej. Po okresie uodpornienia samice myszy zakażane chlamydiami wykazały istotne ograniczenie bakteryjnej infekcji w obrębie błony śluzowej.

chlamydia

Chlamydia trachomatis (brązowe) na podłożu McCoya

Autor: Marcus007

Źródło: wikipedia.org

To zdjęcie zostało wykonane przez Centers for Disease Control and Prevention (CDC) będących częścią The United States Department of Health and Human Services (HHS) w ramach obowiązków służbowych. Będąc dziełem U.S. federal government,znajduje się w domenie publicznej

Krypty mogą się okazać również pomocne w walce z rakiem. Limfatyczna chemokina CCL21 przyłącza się do receptora chemokiny CCR7 i staje się chemoatraktantem dla komórek systemu immunologicznego zwalczających guzy. Pulmonolog Steven Dubinett (UCLA ) i immunolog Sherven Sharma (UCLA) wraz ze współpracownikami wstrzykiwali CCL21 myszom chorym na raka płuc. Niestety, z powodu małych rozmiarów, CCL21 pierzchała poza obszar guza, co czyniło ją nieefektywną we wskazywaniu komórkom immunologicznym drogi do guza. We współpracy z grupą Rome’a naukowcy oznaczyli chemokinę za pomocą mINT, by zapakować ją do krypt celem późniejszego wstrzyknięcia. Zabieg ten zwiększył liczbę leukocytów przenikających do guza, a co ważniejsze, doprowadził do widocznemu ograniczeniu wzrostu guza.11 Po tym sukcesie Rome wraz z zespołem założył firmę w celu umożliwienia, bazującej na kryptach terapii, testów na ludziach (Przeczytaj „Otwieranie krypty medycyny” poniżej).

Trzy dekady od odkrycia krypty wciąż pozostają zagadką. Naukowcy mimo wielu niewiadomych już wykorzystują te organelle. Oparte o krypty terapie dają obiecujące rezultaty, a takie sukcesy wpływają na wzrost zainteresowania tymi mikroskopijnymi beczułkami.

Eufemia S. Putortì niedawno zyskała tytuł licencjata biotechnologii medycznej i farmaceutycznej na Vita-Salute San Raffaele University w Milanie, pisząc pracę o historii i funkcjach krypt. W czasie studiów odbywała staż w laboratorium Massimo P. Crippa’y; teraz pracuje nad magisterium w obszarze molekularnej i komórkowej biotechnologii medycznej.

Otwieranie krypty medycyny

krypta z CCL21

KRYPTY PRZECIWRAKOWE: Poprzez tagowanie cytokiny CCL21 za pomocą sekwencji mINT pochodzącej z C-końca białka VPARP, naukowcy przygotowali krypty przenoszące proteiny aktywujące odpowiedź immunologiczną. Takie krypty wypełnione CCL21 wykazały spory potencjał leczniczy raka płuc u myszy, a kliniczne testy na ludziach prawdopodobnie zaczną się przed końcem roku. © LAURIE O’KEEFE

Piętnaście lat temu, doktor Andy Stephen przedstawił mi zaskakujące wyniki. Ponieważ potrzebował do prowadzonych badań dużych ilości głównego białka krypty (MVP), wywołał jego ekspresję w komórkach owadów, które, w przeciwieństwie do większości zwierząt, nie posiadają krypt. Ku naszemu wielkiemu zaskoczeniu MVP nie tylko było produkowane w dużej ilości, ale też łączyło się w owadzich komórkach w puste, kryptowate twory, a struktura była identyczna z naturalnie występującymi kryptami izolowanymi z innych eukariotów.

To odkrycie postawiło laboratorium na głowie. Moja koleżanka, Valerie Kickhoefer i ja zaczęliśmy projektować krypty, by stały się kapsułkami do wielu zastosowań. Zidentyfikowaliśmy fragment kryptowego białka poli (ADP-rybozy) polimerazy (VPARP), które łączy się z wnętrzem krypt. Włączenie tej sekwencji, zwanej mINT, do dowolnego białka lub peptydu powoduje zapakowanie go do wnętrza krypty oraz, dzięki mocnemu, ale odwracalnemu połączeniu, powolne uwalnianie z krypty. Ponadto przyłączając peptydy do C-końca MVP można zaprojektować krypty zawierające na swojej powierzchni unikalne markery, co pozwala na opracowanie sposobów kierowania krypt do odpowiednich komórek i tkanek.12

By wytwarzać takie krypty do celów medycznych wszedłem w spółkę z przedsiębiorcą Michaelem Laznicka, w 2013 roku założyliśmy Vault Nano Inc. Pierwszym projektem jakim się zajmujemy jest przerobiona krypta zawierająca chemokinę CCL21, która normalnie jest produkowana w węzłach chłonnych, gdzie aktywują limfocyty T oraz komórki dendrytyczne. Wstrzyknięcie takich krypt w guza płuc myszy powoduje, że limfocyty T i komórki dendrytyczne reagują na antygeny guza hamując jego wzrost.13 Aktualnie we współpracy Stevenem Dubinettem and Jay’em Lee z UCLA, Vault Nano aplikuje krypty CCL21 do badań klinicznych, z nadzieją na szybkie rozpoczęcie pierwszej fazy testów. Jeśli odniesiemy sukces, terapia kryptami CCL21 będzie gotowym narzędziem wykorzystującym siłę systemu odporności w walce z rakiem.

Razem z Kathleen Kelly i Otto Yangiem z UCLA zajmujemy się wytworzeniem opartej o krypty szczepionki przeciw chlamydii i HIV. Badania przeprowadzone na zwierzętach wykazały, że jeśli pochodzące od patogena białko lub peptyd zapakujemy do krypty, to powstała kapsułą stymuluje zdecydowaną odpowiedź immunologiczną. Dzięki firmie Vault Nano ta technologia będzie wkrótce testowana klinicznie. – Leonard H. Rome

Literatura:

  1. N.L. Kedersha, L.H. Rome, “Isolation and characterization of a novel ribonucleoprotein particle: Large structures contain a single species of small RNA,” J Cell Biol, 103:699-709, 1986.
  2. A.G. Stephen et al., “Assembly of vault-like particles in insect cells expressing only the major vault protein,” J Biol Chem, 276:23217-20, 2001.
  3. N.L. Kedersha et al., “Vaults. III. Vault ribonucleoprotein particles open into flower-like structures with octagonal symmetry,” J Cell Biol, 112:225-35, 1991.
  4. D.R. Hamill, K.A. Suprenant, “Characterization of the sea urchin major vault protein: a possible role for vault ribonucleoprotein particles in nucleocytoplasmic transport”, Dev Biol, 190:117-128, 1997.
  5. M.J. Poderycki et al., “The vault exterior shell is a dynamic structure that allows incorporation of vault-associated proteins into its interior,” Biochemistry, 45:12184-93, 2006.
  6. R.J. Scheper et al., “Overexpression of a M(r) 110,000 vesicular protein in non-P-glycoprotein-mediated multidrug resistance,” Cancer Res, 53:1475-79, 1993.
  7. G.L. Scheffer et al., “The drug resistance-related protein LRP is the human major vault protein,”Nat Med, 1:578-82, 1995.
  8. K.E. Huffman, D.R. Corey, “Major vault protein does not play a role in chemoresistance or drug localization in a non-small cell lung cancer cell line,” Biochemistry, 44:2253-61, 2005.
  9. V.A. Kickhoefer et al., “Engineering of vault nanocapsules with enzymatic and fluorescent properties,” PNAS, 102:4348-52, 2005.
  10. C.I. Champion et al., “A vault nanoparticle vaccine induces protective mucosal immunity,” PLOS ONE, 4:e5409, 2009.
  11. U.K. Kar et al., “Novel CCL21-vault nanocapsule intratumoral delivery inhibits lung cancer growth,” PLOS ONE, 6:e18758, 2011.
  12. L.H. Rome, V.A. Kickhoefer, “Development of the vault particle as a platform technology,” ACS Nano, 7:889–902, 2013.

Artykuł jest tłumaczeniem:
http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/40599/title/A-Vaulted-Mystery/

Pobierz: PDF, MOBI, EPUB